Интенсификация растениеводства вызывает необходимость разработки и реализации новых способов направленного воздействия на метаболические процессы растений с целью усиления их фотосинтетической активности и минерального питания, ускорения прохождения фенологических фаз и устойчивости к патогенам и вредителям. Такие биотехнологические приемы существенно снижают затратность производства и повышают качество получаемой продукции. Одним из таких приемов является использование высокоэффективных и экологически безопасных регуляторов роста растений.

В сельском хозяйстве наиболее широкое применение нашли ауксины. Они стимулируют рост побегов, основных и придаточных корней, положительно влияют на развитие клеток в фазе растяжения, стимулируют рост клеток камбия, способствуют взаимодействию отдельных органов растений, регулируют их коррелятивный рост [1, 2]. Использование ауксинов чрезвычайно многообразно. Их применяют в овощеводстве, садоводстве, полеводстве, луговодстве и лесоводстве. Существуют как природные ауксины [3], так и их синтетические аналоги, многие из которых обладают большей устойчивостью в тканях растений [4].

Однако существуют ограничения и сложности в широком применении ауксинов, связанные с особенностями их свойств и проявлением биологической активности. Большинство регуляторов роста растений проявляют стимулирующую активность в достаточно узком диапазоне концентраций, превышение которых приводит к ингибированию и даже гибели растений. Многие биологически активные вещества плохо растворимы, что затрудняет их применение в малых дозах. Кроме того, в природных условиях они подвергаются вымыванию, улетучиванию и биологическому разрушению. Для устранения подобных недостатков, по мнению ряда авторов [5, 6] целесообразно использовать системы с так называемым контролируемым выделением активного вещества, в том числе в которых в качестве носителя выступают гуминовые вещества (ГВ).

ГВ являются естественным продуктом биоразложения растительных и животных остатков при почво-, торфо- и углеобразовании [7]. В виде растворимых в воде натриевых, калиевых и аммонийных солей гуминовых кислот (ГК) (гуматов) в настоящее время их самостоятельно широко используют для повышения устойчивости растений к неблагоприятным факторам [8, 9]. Гуматы также эффективно улучшают всхожесть семян, увеличивают массу корней и их разветвленность, снижают заболеваемость растений, увеличивают приживаемость рассады и саженцев и способствуют завязыванию плодов [10–12].

В связи с вышесказанным существенный интерес представляют исследования ГК, посвященные их химической модификации ауксинами, позволяющие получить препараты с целенаправленно измененной или усиленной биологической активностью.

Цель работы – исследование химической модификации торфяных ГК путем введения в их структуру фрагментов природных и синтетических фитогормонов: 3-индолилмасляной кислоты (ИМК), α-нафтилуксусной кислоты (НУК) и п-толилуксусной кислоты (ТУК) и изучение биологической активности полученных препаратов.

Выделение ГК из торфа.
Препараты торфяных ГК выделяли щелочной экстракцией из низинного торфа Рязанской обл. Согласно [13], измельченный торф несколько раз обрабатывали смесью бензол–этанол (1 : 1) в соотношении торф: экстрагент = 1 : 3. Обработку проводили до тех пор, пока экстрагируемый раствор не становился почти бесцветным. После экстракции торф высушивали при температуре 40–60 °C в течение 8 ч до исчезновения запаха бензола. Затем торф заливали раствором 0.1 M NaOH в соотношении 1 : 3 и оставляли на ночь. Щелочной раствор сливали и отфильтровывали. Экстракцию повторяли несколько раз до тех пор, пока экстракт не становился слабо окрашенным. Порции щелочного экстракта объединяли и обессоливали путем диализа.

Для выделения гуминовых кислот полученный щелочной экстракт подкисляли с помощью HCl до рН 2.0 и оставляли на ночь. Затем декантированием отделяли раствор фульвокислот от осадка гуминовых кислот. Осадок гуминовых кислот промыли дистиллированной водой до рН ~ 6.0 и центрифугировали в течение 10–15 мин при 8 тыс. об/мин. Гуминовые кислоты были высушены над безводным CaCl₂ при 20 °C до постоянной массы и перетерты в агатовой ступке до мелкодисперсного состояния.

Выбор способа модификации.
Все использованные модифицирующие агенты представляют собой карбоновые кислоты. Поэтому для химической модификации исходных ГК были предварительно получены хлорангидриды всех вышеперечисленных фитогормонов. Поскольку 3-индолилмасляная кислота ацидофобна, получение ее хлорангидрида, а также хлорангидридов 2-х других синтетических ауксинов проводили в мягких условиях, исключавших появление в реакционной массе свободного HCl, согласно обобщенному уравнению [14]:

Затем проводили обработку растворами RCOCl в безводном тетрагидрофуране (ТГФ) исходных ГК в присутствии триэтиламина в качестве акцептора выделяющегося при ацилировании HCl. Соответствующие обобщенные уравнения реакций могут быть представлены в следующем виде:

Таким образом, в ходе данной модификации с хлорангидридами RCOCl предположительно реагируют спиртовые (возможно, также фенольные и карбоксильные группы; последние – с образованием соответствующих смешанных ангидридов RCOOH и ГК) и аминогруппы исходных ГК с образованием соответствующих сложных эфиров и амидов. Кроме основных реакций ацилирования в реакционной массе проходит также и побочная реакция взаимодействия триэтиламина с карбоксильными группами ГК с образованием водорастворимого гумата триэтиламмония:

В дальнейшем во время фильтрации при промывке продукта водой данный гумат удаляется в виде темно-коричневого раствора, поскольку именно он, в отличие от исходных и модифицированных ГК, является водорастворимым. В связи с этим масса конечных продуктов модифицированных ГК оказывается меньше массы навески исходных ГК.

Получение растворов хлорангидридов модификаторов в безводном ТГФ.
К раствору 0.005714 моль каждого модификатора в 30 мл безводного ТГФ в колбе Эрленмейера на 100 мл в атмосфере сухого аргона при комнатной температуре и непрерывном перемешивании магнитной мешалкой последовательно добавляли (0.005714 моль) перекристаллизованного из этанола трифенилфосфина и 10 мл безводного свежеперегнанного четыреххлористого углерода. После добавления реагентов реакционную смесь оставляли при комнатной температуре на 72 ч. В результате реакции на дне и стенках колбы формировался налет кристаллического трифенилфосфиноксида (C₆H₅)₃PO. Раствор хлорангидрида модификатора быстро фильтровали через ватный тампон в наполненную сухим аргоном капельную воронку на 100 мл. Реакционную колбу с налетом (C₆H₅)₃PO дополнительно ополаскивали 10 мл сухого ТГФ, который затем через тот же ватный тампон фильтровали в капельную воронку с раствором хлорангидрида модификатора. Капельную воронку далее дополнительно продували сухим аргоном, плотно закрывали полиэтиленовой пробкой и оставляли для следующей стадии синтеза.

Получение препаратов модифицированных ГК.
К 10 г суспензии исходных тонкорастертых ГК в 30 мл безводного ТГФ, помещенной в 4-горлую колбу вместимостью 250 мл с обратным холодильником, краном для ввода аргона и 2-мя капельными воронками на 100 мл (в 1-й – полученный на предыдущей стадии раствор хлорангидрида модификатора, во 2-й – раствор 0.8 мл триэтиламина в 40 мл безводного ТГФ (атмосфера сухого аргона), при непрерывном перемешивании магнитной мешалкой в течение 3 ч одновременно добавляли из 2-х капельных воронок полученный на предыдущей стадии раствор хлорангидрида модификатора и раствор 0.8 мл триэтиламина в 40 мл безводного ТГФ. После добавления реагентов перемешивание реакционной смеси при комнатной температуре в атмосфере сухого аргона продолжали в течение 72 ч, после чего ее отфильтровывали под вакуумом на мелкопористом фильтре Шотта № 4. Осадок на фильтре затем последовательно промывали 4 раза 10 мл дистиллированной воды, 3 раза – 10 мл безводного ТГФ и трижды – 10 мл безводного дихлорметана (ДХМ). Полученные препараты модифицированных ГК (ИМК-ГК, НУК-ГК и ТУК-ГК) далее высушивали в сушильном шкафу при 40 °C до постоянной массы.

Как исходные ГК, так и все полученные модификанты были изучены методами ИК-спектроскопии, была определена их зольность и проведен элементный анализ. Зольность определяли с целью последующего пересчета данных исходного элементного анализа на состав органической массы анализируемых ГК.

ИК-спектроскопия исходных и модифицированных ГК.
ИК-спектры исходных и модифицированных ГК (рисунок), снимали на ИК-Фурье-спектрометре “Nikolet­380”. Для всех проб были соблюдены одинаковые условия: масса навески – 0.002 г; масса KBr – 0.2 г.

Определение зольности.
Определение зольности исходных и модифицированных ГК выполняли согласно ГОСТ 11306-2013 [15]. Результаты приведены в табл. 1.

Элементный анализ.
Элементный анализ исходных и модифицированных ГК был выполнен на газохроматографическом элементном анализаторе “Carlo Erba­1100”. Результаты приведены в табл. 1.

Вегетационный опыт по изучению биологической активности исходных и модифицированных ГК.
Сравнительное изучение биологической активности исходных и модифицированных ГК выполняли в НПЦ «Фитогенетика» (г. Тула) на этапе адаптации юных растений малины (Rubus idaeus) в тепличных условиях. Эксперименты проводили с элитными растениями малины сорта Жар-птица, полученных методом клонального микроразмножения. Исходные ГК, а также препараты модифицированных ГК в количестве 0.1 г были растворены в 100 мл 0.1%-ного раствора КОН в дистиллированной воде, после чего полученные растворы были разбавлены дистиллированной водой в 10 раз (доведены до 1.0 л) так, чтобы концентрация препаратов составила ~0.01 мас. %. pH полученных растворов составил ~10.0. Поэтому была проведена нейтрализация растворов концентроированной Н₃РО₄ до рН ~7,5. Перед непосредственным использованием полученные растворы светло-коричневого цвета взбалтывали. В каждый сосуд высаживали по 30 молодых растений малины; эксперимент проводили в трехкратной повторности. Экспериментальные растения 3 раза в неделю обрабатывали 0.01%-ными растворами исходных и модифицированных ГК, а также чистой водой без ГК. Через 2 нед от начала эксперимента растения были осторожно изъяты из грунта и тщательно промыты водой, после чего были изучены их биометрические показатели и выживаемость в разных вариантах обработок.

Экспериментальное подтверждение вхождения модификаторов в состав ГК.
Согласно работам [16, 17], метод ИК-спектроскопии может дать удовлетворительные доказательства химического взаимодействия между гуминовыми веществами и фрагментами модификатора. Показано, что в ИК-спектре ИМК-ГК по сравнению с исходными ГК наблюдали выраженное увеличение интенсивности полосы поглощения при 3400 см⁻¹ , что соответствовало валентным колебаниям ОН- и NH- связей, ассоциированных водородными связями. Согласно [18–20], это могло свидетельствовать о появлении индольных циклов в составе ГК. Кроме того, в ИК-спектре ИМКГК наблюдали увеличение интенсивности полос поглощения при 2920 и 2850 см⁻¹, соответствующих валентным колебаниям СН-связей в метиленовых группах. Это указывало на увеличение содержания последних в составе ИМК-ГК. Увеличение интенсивности широкой полосы поглощения от 1500 до 1800 см⁻¹ с максимумом при 1621 см⁻¹ в спектре ИМКГК могло указывать на рост содержания амидных и сложноэфирных групп в составе ИМК-ГК. Незначительное увеличение интенсивности широкой полосы поглощения от 830 до 1250 см⁻¹ с максимумом при 1032 см⁻¹ в спектре ИМК-ГК, соответствующее плоским деформационным колебаниям связей С–С, С–О и др., позволило предположить увеличение содержания сложноэфирных групп в составе ИМК-ГК.

В ИК-спектре НУК-ГК наблюдали увеличение интенсивности полос поглощения при 2920 и 2850 см⁻¹, соответствующих валентным колебаниям СН-связей в метиленовых группах. Это указывало на увеличение содержания последних в составе НУК-ГК. Увеличение интенсивности широкой полосы поглощения от 1500 до 1800 см⁻¹ с максимумом при 1633 см⁻¹ в спектре НУК-ГК могло, с одной стороны, свидетельствовать об увеличении содержания конденсированных ароматических структур, а с другой – указывать на увеличение содержания амидных и сложноэфирных групп в составе НУК-ГК. Незначительное увеличение интенсивности широкой полосы поглощения от 830 до 1250 см⁻¹ с максимумом при 1033 см⁻¹ в спектре НУК-ГК, соответствующее плоским деформационным колебаниям связей С–С, С–О и др., позволило предположить увеличение содержания сложноэфирных групп в составе НУК-ГК.

В ИК-спектре ТУК-ГК наблюдали увеличение интенсивности полос поглощения при 1920 и 1850 см⁻¹, соответствующих валентным колебаниям СН-связей в метиленовых группах. Это указывало на увеличение содержания последних в составе ТУК-ГК. Увеличение интенсивности широкой полосы поглощения от 1500 до 1800 см⁻¹ с максимумом при 1633 см⁻¹ в спектре ТУК-ГК могло, с одной стороны, свидетельствовать об увеличении содержания ароматических структур, а с другой – указывать на увеличение содержания амидных и сложноэфирных групп в составе ТУК-ГК. Незначительное увеличение интенсивности широкой полосы поглощения от 830 до 1250 см⁻¹ с максимумом при 1032 см⁻¹ в спектре ТУК-ГК, соответствующее плоским деформационным колебаниям связей С–С, С–О и др., позволило предположить увеличение содержания сложноэфирных групп в составе ТУК-ГК. Таким образом, все изменения в ИК-спектрах модифицированных ГК по сравнению с ИК-спектрами исходных ГК отражали модификацию последних введением в их состав фрагментов использованных модификаторов.

Результаты элементного анализа, представленные в табл. 1, качественно и количественно подтвердили выводы, полученные методом ИК-спектроскопии. Например, в составе ИМКГК наблюдали увеличение содержания углерода, водорода и азота по сравнению с исходными ГК. Это также свидетельствовало о вхождении фрагментов ИМК в структуру исходных ГК. В составе НУК-ГК также наблюдали увеличение содержания углерода и водорода. С другой стороны, в этом препарате отмечено снижение содержания азота и кислорода по сравнению с исходными ГК. Это также свидетельствовало о вхождении фрагментов НУК в структуру исходных ГК. В составе ТУК-ГК наблюдали увеличение содержания углерода и водорода. Но в этом препарате отмечено снижение содержания азота и кислорода по сравнению с исходными ГК. Это также свидетельствовало о вхождении фрагментов ТУК в структуру исходных ГК.


На основании данных табл. 1 была определена степень модификации (η) исходных ГК. Расчет проводили по формуле:

где – ωэ(мод.ГК) содержание определяемого элемента (С, Н, N) в модифицированных ГК, ωэ(исх.ГК) – содержание определяемого элемента (С, Н, N) в исходных ГК, ωэ(в RCO–) – содержание определяемого элемента (С, Н, N) в ацильном фрагменте модификатора (табл. 2). На основании полученных данных величина η составила для изученных фрагментов модификаторов (ИМК, НУК и ТУК) в модифицированных ГК приблизительно 5.8, 5.3 и 4.2% соответственно.

Биологическое действие модифицированных ГК на молодые растения малины.
В качестве параметров биологического действия синтезированных препаратов в данном эксперименте использовали следующие показатели: число выживших растений, среднюю длину стебля, среднее число образовавшихся листьев, среднюю длину главного корня и число придаточных корней (табл. 3). Показано, что обработка молодых растений немодифицированными ГК вела к значимому увеличению количества листьев на побеге, длины стебля и главного корня. Отмечена тенденция

к увеличению числа придаточных корней. В целом выживаемость растений также несколько возрастала. Однако воздействие на изученные параметры исходных ГК было гораздо слабее, чем полученных препаратов.

Ряд авторов подчеркивал, что гуминовые препараты оказывали заметное действие на продукционный процесс растений только при применении в комплексе с другими ростактивирующими веществами [21]. С другой стороны, гуминовые препараты, по-видимому, не обладают достаточным ростактивирующим эффектом для развития корневой системы растений, рост которой является результирующей величиной действия комплекса факторов. Возможно, гормоноподобную активность проявляют только определенные фракции гуминовых веществ, особенно низкомолекулярные фракции гуминоподобных веществ [22].

Согласно данным табл. 3, ИМК-ГК и НУК-ГК по всем параметрам превосходили как влияние исходных ГК, так и полив чистой водой. Это было характерно для таких показателей, как длина стебля, длина главного корня и число выживших растений, по которым полученные модификанты существенно превосходили действие исходных ГК. Например, по такому показателю, как высота растений, препарат ИМК-ГК превосходил исходные ГК на 64%. Соответственно, препарат НУК-ГК по этому показателю превосходил исходные ГК на 71%. Препарат ТУК – ГК обладал наибольшим эффектом – превосходил исходные ГК на 79%. Действие препарата ИМК-ГК на длину главного корня превосходило исходные ГК на 55%. Препарат НУК-ГК был активнее исходных ГК также на 55%. Препарат ТУК-ГК обладал несколько меньшей активностью, а именно влиял на длину главного коргя на 31% эффективнее, чем исходные ГК. Наименьшее количество выживших растений было отмечено среди растений, обработанных модифицированными НУК-ГК, что указывало на меньшее адаптогенное действие НУК-ГК по сравнению с другими препаратами модифицированных ГК. Показано, что другие модифицированные ГК (особенно ИМКГК и ТУК-ГК) являлись не только стимуляторами роста, но и высокоэффективными адаптогенами, поскольку в их присутствии число погибших растений было минимальным. Все вышесказанное позволило рекомендовать препараты ИМК-ГК, НУК-ГК и ТУК-ГК к применению в сельском хозяйстве в качестве стимуляторов роста и укоренения растений малины, а ИМК-ГК и ТУК-ГК –также в качестве эффективных адаптогенов.

1. Хлорангидридная химическая модификация гуминовых кислот (ГК) является эффективным методом, позволяющим вводить фрагменты ауксиновых модификаторов в структуру

исходных ГК (с приблизительной массовой долей фрагмента модификатора в ИМК-ГК – 5.8, в НУК-ГК – 5.3, в ТУК-ГК – 4.2%).

2. Синтезированные модифицированные препараты гуминовых кислот были более эффективными стимуляторами роста и защиты молодых растений малины по сравнению с исходными ГК.

3. Полученные в результате вегетационных экспериментов данные позволяют рекомендовать применение синтезированных препаратов при выращивании культуры малины.